Analiz, Hizmet, Laboratuvar, Atölye ve ARGE'de en iyisi.
Çünkü, sizinle çalışıyoruz....
MANTARDAN DNA İZOLASYONU SOLVER PROTOKOL
BAŞLAMADAN ÖNCE HAZIRLANMASI GEREKEN KİMYASAL VE TAMPONLAR
CTAB tamponu (Cetyltrimethylammonium Bromide Tamponu)
%2 CTAB
100 mM Tris-HCl (pH 8.0)
1.4 M NaCl
20 mM EDTA (pH 8.0)
0.2% β-merkaptoetanol (DNA oksidasyonunu engellemek için, çalışmadan hemen önce hazırlanıp eklencek)
Proteinaz K (20 mg/mL)
RNAaz A (10 mg/mL)
Fenol:kloroform:izoamil alkol (25:24:1)
Kloroform:izoamil alkol (24:1)
İzopropanol (soğutulmuş, DNA çöktürme için)
%70 Etanol (soğuk, DNA yıkama için)
TE Tamponu (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0, DNA çözme için)
İZOLASYON AŞAMALARI
Mantar Hücrelerinin Homojenizasyonu ve Hücre Lizi
Mantar örneklerini önceden -80°C’de 10 dk dondurulur.
Bead-beater kullanarak çelik veya cam bilyeler ile 3 dk 50ms/sn parçalama yapılır. Parçalam işlemi tam olmaması durumunda 2 kez yapılabilir.
Çelik bilye çıkrıldıktan sonra üzerine 700 µL önceden hazırlanmış CTAB tamponu eklenir.
Karışıma 2 µL β-merkaptoetanol eklenir (bu bileşen, DNA'nın oksidasyonunu önler).
Karışım 65°C’de 100rpmde 30-45 dakika inkübe edilir.
Örneklerin üzerine 700 µL fenol:kloroform:izoamil alkol karışımı eklenir.
Karışımı 5 dakika boyunca 21C'de 200 rpmde çalkalayıcıda bekletilir.
4°C’de, 14.000 rpm’de 10 dakika santrifüj edilir.
Üst fazı (sulu faz, DNA içeren kısım) dikkatlice yeni bir tüpe alınır.
Üst faza eşit hacimde kloroform:izoamil alkol (24:1) eklenir.
Elle hafifçe karıştırılır ve 4°C’de 14.000 rpm’de 10 dakika santrifüj edilir.
Üst fazı dikkatlice yeni bir tüpe aktarılır.
DNA Çöktürme:
DNA içeren üst faza eşit hacimde soğutulmuş izopropanol eklenir.
Ters çevirerek çok dikkatli bir şekilde karıştırılır ve -20°C’de 30-60 dakika bekletilir.
4°C’de, 14.000 rpm’de 15 dakika santrifüj edilir.
Üst fazı ÇOK dikkatlice döküp, tüp içinde beyaz DNA pelletinin oluştuğunu görülmesi gerekmektedir.
DNA Yıkama:
DNA pelleti soğuk %70 etanol ile yıkanır (DNA pelletinin üzerine 1 mL etanol eklenir).
Hafifçe ve DİKKATLİCE karıştırılır ve 14.000 rpm’de 5 dakika santrifüj edilir.
Üst fazı DİKKATLİCE dökün ve pelletin kurumasını beklenir (hava ile kurutun, tamamen kuruması için yaklaşık 5-10 dakika bekleyin).
DNA pelleti 50 µL TE tamponu veya steril ultra saf suda (ddH2O) çözdürülür.
Hafifçe pipetle DİKKATLİCE karıştırarak veya 37°C’de 15 dakika inkübe ederek çözülmesini sağlayın.
1 µL RNAaz A (10 mg/mL) ekleyin ve 37°C’de 30 dakika inkübe edin.
Qubit veya benzeri bir cihaz kullanarak A260/A280 oranını ölçün.
A260/A280 oranı 1.8-2.0 arasında ise DNA saflığı iyidir.
A260/A230 oranı 2.0 civarında olmalıdır (düşükse, fenol veya tuz kontaminasyonu olabilir).
Agaroz Jel Elektroforezi:
%1 agaroz jel hazırlayın ve SYBR Dyes ile boyanır.
5 µL DNA örneği 1µL yükleme boyası (loading dye) ile karıştırarak jelde çalıştırılır.
UV transillüminatörde DNA’nın sağlamlığını kontrol edilir.
Kısa süreli saklama için: 4°C’de saklayın.
Uzun süreli saklama için: -20°C veya -80°C’de saklayın.
