Analiz, Hizmet, Laboratuvar, Atölye ve ARGE'de en iyisi.
Çünkü, sizinle çalışıyoruz....
EKSPRESYON ANALİZİ
RNA izolasyonu
…..den alınan …… örnekler sterilize edilmiş bir spatula ile dikkatlice alınacak ve ……mg tartılacaktır. Dokular, RNaz içermeyen bir tüpe yerleştirilecek ve üzerine 500 µl TRIzol (Softec, Cat no: 1024-00-0023) Reaktifi eklenecektir. Dokular, homojen bir karışım elde edilene kadar doku homojenizatörü ile çelik bilye kullanılarak iyice parçalama işlemi gerçekleştirilecektir. Homojenize edilmiş karışım oda sıcaklığında 5 dakika bekletilerek RNA'nın hücresel komponentlerden ayrışması sağlanacaktır. Ardından, 14000 rpm’de 10 dk santrifüj işlemi gerçekleştirilecektir. Üst faz yeni bir tüpe aktarılacaktır. Üst faza 250 µl kloroform eklenip tüp çalkalanarak 15 saniye iyice karıştırılacaktır. Tüp 10 dakika oda sıcaklığında inkübe edilecektir. 15 dk boyunca 14000 rpm hızında santrifüj edilecektir. Santrifüj sonrası üst faz dikkatlice alınıp yeni bir tüpe aktarılacaktır. Üst faza 500 µl izopropanol eklenip tüp elde yavaşça karıştırılacaktır. Karışım, RNA'nın çökelmesi için 10 dakika boyunca oda sıcaklığında bekletilecektir. Tüp tekrar 15 dakika boyunca 14000 rpm hızında santrifüj edilecek ve RNA peleti tüpün dibinde toplanacaktır. RNA peleti, üzerindeki sıvı dikkatlice uzaklaştırılarak 1 ml hacminde %75’lik etanol ile yıkanacaktır. Etanol yıkaması sonrası tüp 5 dakika boyunca 10400 rpm hızında santrifüj edilecektir. Yıkama sıvısı uzaklaştırılacak ve RNA peleti oda sıcaklığında kurutulacaktır. Kuru pelet 30 µl nükleaz içermeyen su ile çözülerek hazır hale getirilecektir (Önalan, 2019).
cDNA sentezi
cDNA sentezinin tüm aşamaları +4 oC’de soğuk plaka üzerinde gerçekleştirilecektir. cDNA sentezi için All in one cDNA synthesis kit (ABClone, Cat no: RK20400) kullanılacaktır. İzole edilen 90 µl RNA 200 ng konsantrasyonda eşitlenecektir. Ardından, 18 µl RNA, d(T)23 VN 4 µl, 10nM dNTPs 2 µl, ABScript II reaction Mix (2x) 20 µl, ABScript II Enzyme mix 4µl nükleaz içermeyen su 2µl olacak şekilde cDNA karışımı hazırlanacaktır. cDNA protokolü üretici firmanın talimatları doğrultusunda 42 °C’de 60 dakika ve sonrasında 80 °C’de 10 dakika inkübe edilecektir (Mohammadabadi ve ark., 2024).
Gen ekspresyon analizi
cDNA ürünleri RotorGene Q 9000 (Qiagen) cihazında SybrGreen qPCR Master Mix (Solver, Cat no: Slv-M-2021-002) kullanılarak Real-Time PCR analizinde kullanılacaktır. Gen ekspresyonu analizinde ………. referans gen olarak analiz edilecektir. Hedef gen olarak ……………genlerine ait primerler sentezlenecektir.
PCR karışımı 12,5 µl SYBRGreen qPCR Master Mix (Solver), 2 µl forward ve 2 µl reverse primer, 4,5 µl H2O eklenip toplam hacim 21 µl’ye tamamlanacaktır. 4 µl cDNA eklenerek toplam hacim 25 µl olarak PCR bileşenleri tamamlanacaktır. PCR döngü koşullarında, 95 oC’de 10 dk boyunca ön denatürasyon, ardından; 95 oC’de 45 sn, her gen için ayrı primer bağlanma sıcaklıklarında 60 saniye, 72 oC’de 30 sn uzama ile 45 döngü olarak Real-Time PCR protokolü tamamlanacaktır (Ekawasti ve ark., 2024).
İstatistik analiz
Real-Time PCR analizi sonrasında her gen için ayrı ayrı elde edilen Ct değerleri Solver biyoinformatik analiz programında (Bio-Q) gen ekspresyon analizi sekmesi kullanılarak normalizasyon işlemi ve ardından 2 ΔΔct -log değerleri elde edilerek gen ekspresyon düzeyleri belirlenecektir. İstatistiksel farklılık düzeyi p<0,05 olarak değerlendirilecektir (Önalan and Çevik, 2020).
MİKROBİATA ANALİZİ
Örneklerden DNA izolasyonu
……. örneklerinden genomik DNA izolasyonu Bacterial Fecal/Soil DNA Isolation kit kullanılarak üretici firmanın talimatları doğrultusunda gerçekleştirilecektir. İzole edilen DNA’nın miktarı florometrik olarak Qubit 3.0 ile tayin edilecektir.
16s rRNA V3-V4 bölgesinin amplifikasyonu
Tür tayininde kullanılacak olan 16s rRNA genine ait V3-V4 bölgeleri 341F-805R primer dizileri ile SimpliAmp Thermal Cycler kullanarak amplifiye edilecektir. Primer dizileri: 341F: 5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3' ve 805R 5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3' olarak kullanılacaktır. PCR koşulları aşağıda verilmiştir.
95°C’de 5 dakika – ilk denatürasyon (HS enzim kullanılacaktır)
35 döngü:
— 95°C’de 30 saniye - denatürasyon
— 53-50°C’de 30 saniye – bağlanma (touchdown PCR)
— 72°C’de 30 saniye – uzama
Sıcaklık 4°C’ye düşürülüp PCR tamamlanacaktır.
Kütüphane hazırlama ve dizileme işlemi
16s rRNA V3-V4 amplikon ürünleri dizileme işleminden önce Qiagen firmasına ait “Qiaseq beads Clean-Up Kit, Cat. No.:180795” ile saflaştırılacaktır. 16s rRNA V3-V4 amplikon ürünleri için kütüphane hazırlama Illumina’nın “Nextera XT DNA Library Prep Kit, Cat. No.: FC-131-1096” ile index işlemi ise “TG Nextera XT Index Kit v2 Set A (96 Indices, 384 Samples), Cat. No.: TG-131-2001” ile yapılacaktır. Kütüphanelerin konsantrasyonları iQuant™ dsDNA HS Assay Kit (ABP Bioscience, USA) kiti kullanılarak tespit edilecektir. Dizileme işlemi Illumina iSeq100 platformu ile paired-end (PE) 2x150 olarak yapılacaktır.
Ham verinin biyoinformatik analizi
Ham veri okumaları (FASTQ), Kraken Metagenomik sistemi ile OTU sınıflarına ayrılacaktır. DNA sekanslarına taksonomik etiketler kodlama sistemi ile gerçekleştirilecektir. Biyoinformatik analiz esnasında, sınıflandırmada confidence filter: 0.05, minumum hit grup: 2, database RefSeq 2022.02: archaea, bacteria, fungi, protozoa, viral olarak setup işlenecektir.
Teknik Şartname
Örnekler firma tarafından alınacaktır.
İzolasyon için gerekli kitler ve tüm sarf malzeme firmaya aittir.
Çalışmada firmaya verilecek ........ numunenin biri ile çalışma bilrikte yapılacak diğeri çalışma sonuna kadar bekletilecektir. Herhangi bir olumsuz durumda diğer grup ile çalışma tekrarlanacaktır ve tüm masraflar firmaya ait olacaktır.
NGS flow yüklemesi proje ekibi ile birlikte gerçekleştirilecektir.
Toplam genomik DNA'dan hedeflenen amplifikasyon, spesifik rDNA primerleri kullanılarak metabarkodlama kitaplığı yapısı, eşmolar havuzlama, MiSeq yüksek verimli dizileme (Illumina, San Diego, CA, ABD) ve çift uçlu okumalar gerçekleştirilecektir.
Örnekler mikrobiyal kompozisyonun değişmeyeceği standartlarda muhafaza edilmelidir.
İzole gDNA örneklerinin miktarı florometrik olarak Qubit ve Qiaxpert ile desteklenmelidir.
Genomik DNA örneklerinden 16S V3-V4 bölgesi üniversal primerler kullanılarak amplifiye edilmelidir.
Dizileme işlemi yeni nesil dizileme platformu kullanılarak yapılmalıdır.
Kütüphane hazırlanması ve dizileme (Library Preparation + Sequencing) PairedEnd PE 2x150 baz olacak şekilde yapılmalıdır.
Örnek başına en az 30 bin (30K reads/sample) dizi okuması yapılmalıdır.
Okuma sonuçlarının en az %90’nın kalite skoru Q ≥ 30 olmalıdır.
Dizi okumaları sonucunda istenilen bölgenin dizilenememesi durumunda firma yeni primerler tasarlayarak PCR işlemlerini tekrar ederek dizilemeleri tekrar gerçekleştirmek zorundadır.
Biyoinformatik analizler firma tarafında gerçekleştirilmelidir.
Biyoinformatik analizler güvenilirliği yüksek ticari yazılımlar ile yapılmalıdır.
Her bir örneğe ait OTU sınıfları ayrı ayrı .txt/.excel dosyası olarak verilmeli, rarefaction curve, diversity curve ve PCoA plot analizleri yapılmalı ve örneklere ait OTU dağılımlar pie chart grafiği olarak verilmelidir.
Analiz sonuçları detaylı rapor halinde sunulmalıdır.
Ürünlerin uygunluğuna laboratuvarımızda denendikten sonra karar verilecektir.
Teklif veren firma biyoinformatik analiz desteği sağlamalıdır.
Teklif veren firma biyoinformatik program kullanım desteği sağlamalıdır.
Teklif veren firmaların önceden kullanıcıyla iletişime geçmesi gerekmektedir.
Hizmet alımı süresince tüm meydana gelebilecek kargo gönderimleri ve ödemeleri Türkiye’nin tüm illerinde firma tarafından gönderimleri sağlanmalıdır.
Mikrobiata analizi .......adet ve 2 tekerrür örnek için hizmet alımı şeklinde gerçekleştirilecektir.
